第-一天：(猝滅, 抗原修復, 阻斷, 一抗)

• 用 1X TBS (震蕩, 室溫)沖洗切片 5 次以除去冷凍保護劑。

• 把切片放到 0.6% H2O2 的 TBS 中，覆蓋好，置于操作臺20分鐘。

*該步驟不要用MESH WELLS*

用 ___ mL TBS, ___  uL 30% H2O2

• 用 1X TBS (震蕩, 室溫) 沖洗切片3次。

• 做抗原修復時, 提前在水浴中預熱檸檬酸緩沖液至少15~30分鐘。在檸檬酸緩沖液中培養切片一小時，將溫度設置為37℃，不要震蕩 。

• 用 1X TBS (震蕩, 室溫) 沖洗切片3次。

• 阻斷時, 將切片置于 5% 常規驢血清和0.25% Triton-100的TBS 中阻斷 1 小時，冷室、震蕩。

*注意: 可以使用含有Triton的TBS阻斷液 (1 L TBS, 2.5 mL TX-100), 之后只需要向阻斷液中加入驢血清來阻斷。*

用 ___  mL TBS, ___ uL 驢血清, ___  uL 10% TX-100

• 用 1X TBS (震蕩, 室溫) 沖洗切片3次。

• 用含 5% 驢血清的 TBS制備一抗溶液，稀釋度為1：5000。用錫紙包好切片，和抗體一起在冷室中震蕩培養過夜。

用 ___ mL TBS, ___ uL 驢血清, ___ uL pSYN EP1536Y

第二天：(二抗, ABC 擴大信號, DAB 染色)

• 用1X TBST (震蕩，室溫) 沖洗切片3次. 余下的步驟中，需要一直將切片保留在錫紙里，即使是沖洗的步驟。

• 用含5%驢血清的TBS制備二抗溶液，稀釋度為1:500。在冷室中培錫紙養蓋好的切片2小時，震蕩。

用 ___ mL TBS, ___ uL 驢血清, ___ uL 生物素標記的驢抗兔 IgG

• 用1X TBST(震蕩，室溫) 沖洗切片3次。

• 用ABC 試劑培養切片30分鐘 (震蕩, 冷室)。

• 用1X TBS沖洗切片3次 (震蕩，室溫)。

• 用falcon離心管和ddH2O制備DAB溶液，每5mL H2O加入如下溶液然后渦旋混合：

2滴緩沖溶液

4滴 DAB 溶液

2滴雙氧水溶液

*注意: 所有接觸過DAB的器具只能用來操作DAB。我們還在通風櫥內準備了一個DAB專用的廢液缸。使用玻璃鉤來處理DAB溶液中的切片而不能用漆刷，并且操作后要用漂白劑沖洗玻璃鉤。盛裝過DAB的器皿都需要用漂白劑沖洗并且處理到生物性危害箱中。*

• 用注射器過濾到新的6孔板中。每一個需要染色的腦切片都用一個新的DAB孔。

• 在DAB中培養每個切片直到變為淺棕色 (2-3分鐘就足夠; 時間太長可能會造成背景染色太多)

• 用ddH2O沖洗3次

• 在1X TBS中封片，然后在切片柜中干燥過夜。

第三天：(脫水和蓋玻片)

* 注意: 在開始脫水步驟之前，確保浸片用的玻璃皿里有足夠的液體可以蓋過切片上的所有組織。*

-按照如下順序和時間脫水切片：

1. 30 秒 ddH20

2. 3 分鐘70% EtOH

3. 3 分鐘95% EtOH

4. 3 分鐘95% EtOH

5. 3 分鐘100% EtOH

6. 3 分鐘100% EtOH

*置于振蕩器*

7. 5 分鐘 Histoclear

8. 5 分鐘 Histoclear

9. 5 分鐘 Histoclear

• 將切片從切片籃從取出，一次一片，置于吸水紙上。

• 加封片劑時，取一個 P1000 移液器和吸頭，將吸頭尖剪掉，容量設到400到500μL.

• 連續滴幾滴封片劑 Permount 到切片的中間，傾斜切片使封片劑完-全覆蓋切片。

• 用棉棒的木頭一端趕出切片中的氣泡。

• 將切片放在吸水紙上，置于操作臺上過夜晾干。

*注意: ~24 小時之后, 多余的 Permount 封片劑應該用Histoclear移除*

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